免疫印迹实验方案

蛋白提取

细胞来源
准备材料：50× 磷酸酶抑制剂，50× 蛋白酶抑制剂，RIPA，细胞刮，1.5 ml 离心管

1. 50× 磷酸酶抑制剂，50× 蛋白酶抑制剂，溶于 RIPA，现配现用，置于冰上，六孔板 200 μl/孔。
2. 取出培养细胞，用吸液泵吸出培养液（六孔板），移液管吸 PBS，每孔加 1 ml，轻轻上下摇匀，吸液泵吸出。
3. 孔板置于冰上，每个孔加 200 μl 配置好 RIPA。用刮板将细胞刮下，1.5 ml 离心管 收集悬液置于冰上。
4. 超声破碎仪 振幅 45% 破碎 5 s，针尖进入液面一半，悬空。好的破碎状态不会产生细密的气泡，若出现，说明贴壁了。
5. 离心机 4℃ 预冷。冰上裂解 20 min 后离心 15000 G，20 min。取上清。
6. 液氮速冻后保存于 -80℃。

组织来源
准备材料：50× 磷酸酶抑制剂，50× 蛋白酶抑制剂，RIPA，研磨珠， 1.5 ml 离心管

1. 组织匀浆器底座放到 -20℃ 预冷。
2. 配置蛋白提取液（RIPA，蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂），单侧海马需 250 μl（海马一般可取 20～25 μg，10 倍蛋白提取液）。
3. 每个海马加入 250 μl 提取液和 2 个研磨珠，在组织匀浆器中 60 Hz × 60 s研磨两次，两次间隔 60 s。
4. 离心机 4℃ 预冷。冰上裂解 30 min，标记新的离心管。
5. 15000 G × 15 min 离心，取上清。液氮速冻保存于 -80℃。

蛋白定量

标准蛋白样品配制
用蛋白标准品 (BSA) 稀释，配置 8 个梯度。

蛋白标准品成分表

注：BSA 原液是 2 mg/ml，未标括号用的是原液
A: 360 μl BSA 原液
H：360 μl ddH₂O
配制后用涡旋仪将液体混匀，放于 4℃ 保存。

蛋白定量与上样体系配制
准备材料：BCA液 (A/B)，96孔板，RIPA（加双抑制剂），4× loading buffer（含巯基乙醇）

1. BCA 液配制
   • A 液 ∶ B 液 = 50 ∶ 1
   • 96 孔板中每孔需 200 μl BCA 液
     例如，10 个样品 + 8 个 标蛋（2组复孔）
     (10 + 8) × 2 × 200 μl = 7200 μl (A: 7.2 ml，B: 144 μl)
2. 在 96 孔板中，标蛋和样品都做2组复孔。标蛋每个上样 10 μl，样品每孔 2 μl + 8 μl 蛋白提取液（样品使用前涡旋 15 s，离心 15 s），移液枪每次换枪头。然后算上 16 个标蛋，每孔加入 200 μl BCA 液。加BCA液时，移液枪吸一档，只打第一档，手法保持一致，上样位置一致，保证上样量相同（先加蛋白再加蛋白提取液）。
3. 37℃ 温箱反应 30 min。
4. 打开酶标仪
   • 创建Plate 1
   • setting → wave length 562 nm
   • template editor → 选择标蛋 → standard → edit → 选择 μg/ml mass → assign
   • 标记标蛋位置、浓度及名称
   • 选择样品 → unknown → edit → 取消单位 → 命名每个样品 → 右键 clear 空白区域
   • 浓度计算公式选择 linear
   • read 读板，CV < 10，R² > 0.995 为优秀数据
   • 保存数据 save as 源文件 → export 数据至Excel，在 Excel 中打开进行后续计算
5. 计算稀释方案
   • 公式：C_初始 × V_初始 = C_稀释 × V_稀释
     • V_稀释为配制好的蛋白液体积，含有蛋白、4× loading buffer、RIPA
     • V_稀释 一般为 60 μl，一般上样蛋白量为 15~30 μg/孔，根据跑胶次数配
     • 1.5 mm 胶每孔上样体积为 20~30 μl/孔（10孔齿）或 10 μl/孔（15孔齿）
     • C_稀释 取决于所测蛋白浓度最低的一组，由于 4× ld 的存在，该浓度值需要乘 3/4
     • 在 Excel 中计算加入各种液体的体积，先确定 V_稀释，计算 V_初始，4× ld 体积是确定的，RIPA 体积用 V_稀释 减去其余体积得到
6. 配制完毕，用涡旋仪将液体混匀后瞬离至管底，立即置于 99℃ 金属浴中加热变性 5 min，随后立即置于冰上冷却 10 min。混匀瞬离后，可立即使用，也可液氮速冻后保存于 -80℃。

电泳

制胶
根据目的蛋白分子量大小配制不同浓度的 SDS-PAGE 分离胶。

压缩胶与分离胶成分表（2 块 1.5 mm 胶）

1. 取出洗净并烘干的制胶玻璃板，对齐置于制胶架上。配制下层分离胶，涡旋混匀后，立即从制胶玻璃板一侧加进两块制胶玻璃板中。
2. 沿着玻璃板边缘从左至右加入 1 ml 无水乙醇，起到消除气泡及密封的作用。室温静置约 40 min。
3. 待分离胶凝固后，弃去无水乙醇，倒置 10 min，直至无水乙醇挥发干净。
4. 配制上层压缩胶，涡旋混匀后，立即从制胶玻璃板一侧加进两块制胶玻璃板中。沿着玻璃板边缘从左至右小心插入梳齿，边移动梳齿边赶走气泡。室温静置约 40 min，直至压缩胶凝固。

电泳

1. 取出 2 块制备好的胶，对齐，小心卡进胶夹中。在两块胶中间以及外侧加满电泳缓冲液。

电泳缓冲液成分

2. 小心移除梳齿后，在第一个孔内加入适量 marker，随后按顺序在其余各个孔内加入等体积蛋白样品，若有剩余孔，则加入等体积 4× loading buffer 和裂解液配制而成的「空白液」。
3. 加样结束后，电极接通电源，在恒压模式，80 V，电泳约 40 min，待所有蛋白都进入分离胶后（marker 各个条带分离），电压改成 120 V，继续电泳约 40 min，直至前端条带跑到接近凝胶底部。

转膜

1. 准备尺寸合适的 PVDF 膜（约7.5 cm × 5.5 cm），在甲醇中激活 5 分钟。
2. 取出电泳结束的胶，切除压缩胶，置于预冷的转膜缓冲液中备用。将转膜夹置于预冷的转膜缓冲液内，黑色一侧朝下，先放置一层海绵，再放置两层滤纸，将胶置于滤纸上，小心将甲醇激活后的 PVDF 膜置于胶上，并用刮板小心排出胶和膜之间的气泡，再依次放置一层滤纸和一层海绵，随后夹紧转膜夹。将转膜夹装进转膜电极内，黑色侧（靠近胶一侧）位于负极，白色侧（靠近膜一侧）位于正极。
   三明治结构：正极 - 海绵 - 滤纸 - 膜 - 胶 - 滤纸 - 海绵 - 负极
3. 在转膜槽内放置 -80°C 冷冻的冰袋，并在槽内加满预冷转膜缓冲液。
   转膜缓冲液

   甘氨酸（g）	Tris（g）	甲醇（L）	ddH2O（L）
   144	30	2	（定容至）8

4. 将转膜系统置于 4°C 冰箱内，电极连接电源，在恒流模式下，300 mA，电压不小于 80V，转膜约 90 min。
5. 提前用 TBST 配制 5% 牛奶（一张膜 10~15 ml）。
   TBST

   Tris（g）	NaCl（g）	Tween-20（ml）	ddH2O（L）
   24.2	80	10	（定容至）10

注：在加 Tween-20 之前需先将溶液 pH 调整至 7.6。

显色

1. 封闭
   • 转膜结束后，取出膜，正面朝上（有蛋白一侧为正面），置于孵育盒内，加入 15 ml 5% 牛奶。将孵育盒置于脱色摇床上（跷跷板慢摇），室温孵育 1 小时。
2. 洗膜
   • 封闭结束后，弃去牛奶，TBST涮三次，洗去残余牛奶。
3. 孵育一抗
   • 按照抗体说明书推荐稀释比例（如1 : 1000）配制一抗，稀释液为含 3% BSA的 TBST，并按 1: 1000的比例加入 20% NaN₃ 防腐。
   • 每张膜加入 5 ml 一抗，将孵育盒置于脱色摇床上（跷跷板慢摇），4°C 孵育过夜。
4. 洗膜
   • 回收一抗（一抗可重复利用），加入 TBST，置于脱色摇床上（水平快摇），漂洗 6 次，每次 10 min。
5. 孵育二抗
   • 按照抗体说明书推荐稀释比例配制对应一抗种属的二抗（如 1 : 5000），稀释液为 5% 牛奶。加入 5 ml 二抗，将孵育盒置于脱色摇床上（跷跷板慢摇），室温孵育 30~45 min。
6. 洗膜
   • 弃去二抗，加入 TBST，置于脱色摇床上（水平快摇），漂洗 3 次，每次 10 min。
7. 显影
   • 根据说明书配制适量显影液（ECL A 液 ∶ ECL B 液 = 1 ∶ 1）。提前将显影仪开机，CCD预冷至 -20℃。用吸水纸吸去膜上 TBST，将膜平铺于显影板上，均匀滴加适量 ECL 显影液。在化学发光成像模式下进行显影。需保存膜的原始照片、发光成像照片和两者融合的图像。
   • 若图像效果理想，进一步孵育内参。步骤和前述一致。统计时需将目的条带与内参量相比较。