实时荧光定量PCR实验方案
RNA提取
组织来源
准备材料：Trizol，氯仿，DEPC 水，异丙醇，无水乙醇
- 组织匀浆器底座 -20℃ 提前预冷。
- 离心机提前打开，4℃ 预冷。样本可以新鲜采集，也可预先冻存在 -80℃中。根据样本量，标记离心管，每管加入 1 ml Trizol。（有毒，通风橱中操作）
- 每管加入 2 颗钢珠，在组织匀浆器中 65 Hz 研磨 120 s，涡旋混匀，静置 10 min。
- 每管加入 200 μl氯仿，在通风橱中涡旋混匀 10 s，室温静置 10 min。
- 在 4℃ 下 16000 G 离心 20 min，弃下层沉淀，吸取上清。
- 按照 1 ∶ 2 或 1 ∶ 1 （源体积 ∶ 异丙醇）的比例加入异丙醇。盖上盖子，上下颠倒 10 次（上下为一次）。
- -20℃ 沉淀，大于 2 h，离心机 4℃ 预冷。
- 在 4℃ 下 16000 G 离心 20 min，弃上清。沿沉淀的另一侧倒出。
- 用含 75% 酒精的 DEPC 水清洗沉淀，每管 1ml，涡旋 3~4 次。
- 在 4℃ 下 16000 G 离心 20 min，弃上清，在纸上倒置晾干 10~20 min。
- 加 20 μl 冰浴的 DEPC 水，吹打，使沉淀溶解，置于冰上。
RNA 提出后一定要放冰上，不能放室温。 - 测浓度后，可立即用于逆转录，也可液氮速冻存于 -80℃。
细胞来源
准备材料与组织提取相同
- 在六孔板中贴壁生长的细胞，去掉上清，用 PBS 轻轻洗 2 遍后，每孔加 500 μl Trizol，多次吹打后将液体转移至 1.5 ml 离心管，涡旋混匀，静置 10 min。（进行到这步可以液氮速冻后存于 -80℃）
- 后续步骤与「组织来源」相同，从第 4 步开始。
逆转录合成 cDNA 第一链
使用 翌圣 Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR 试剂盒
试剂盒组分
- RNase-free H2O
- 5× gDNA digester Mix
- 4× Hifair® Ⅲ SuperMix plus
注：4× Hifair® Ⅲ SuperMix plus 含有 gDNA digester 抑制剂。
残留基因组 DNA 去除
- 在 RNase free 离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃ 孵育 2 min。
组分 使用量 Total RNA 1 μg 5× gDNA digester Mix 3 μl RNase-free H2O To 15 μl - 配制母液时需考虑损失体积，单次移液，体积 × 1.04；两次移液，体积 × 1.08
逆转录反应体系配制（20 μl 体系）
- 在第 1 步的反应管中直接加入 5 μl 4× Hifair® Ⅲ SuperMix plus，用移液器轻轻吹打混匀。
逆转录程序设置
温度 时间 25℃ 5 min 55℃ 15 min 85℃ 5 min 可立即用于 qPCR 也可分装后液氮速冻，存于 -80℃。
qPCR
使用翌圣 Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix 试剂盒
准备的材料：试剂盒、cDNA原液、qPCR 96 孔板、封板膜
- 在冰上配置反应体系（96 孔板可卡在底座上，底座置于冰上）。
| 组分 | 体积 (μl) | 体积 (μl) | 终浓度 |
|---|---|---|---|
| Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix | 25 | 10 | 1× |
| Forward Primer (10 μM) | 1 | 0.4 | 0.2 μM |
| Reverse Primer (10 μM)1 | 1 | 0.4 | 0.2 μM |
| 模板 DNA | X | X | - |
| 无菌超纯水 | to 50 | to 20 | - |
- cDNA 原液体积一般不超过反应总体积的 1/10
- 先将体系配好（留好余量，例如配每孔 20 μl 体系，加 19 μl），与复孔 cDNA 预混分装，点板完成后用膜封板，不要触碰到膜中间。再使用离心机甩板，1000 rpm，1 min。
- 定量实验需要至少 2 个 生物学重复
- 需要设置内参
上机
标准程序
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 预变性 | 95℃ | 2 min | 1 |
| 变性 | 95℃ | 10 sec | 40 |
| 退火/延伸 | 60℃ | 30 sec | |
| 熔解曲线阶段 | 仪器默认设置 | 1 | |
- 结果分析
- 扩增曲线：标准扩增曲线为S型。
- Ct值落在 20~30 之间时，定量分析最准确；
- Ct值小于 10，需要将稀释模板后，重新进行实验；
- Ct值介于 30~35 之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；
- Ct值大于 35 时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。
- 熔解曲线：
- 熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。
- 熔解曲线出现双峰，需要通过 DNA 琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。
- 如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。
- 如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。
- 扩增曲线：标准扩增曲线为S型。
- 引物设计指南
- 推荐引物长度 25 bp 左右。扩增产物长度 150 bp 为佳，可以在 100 bp~300 bp 内选择。
- 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不宜超过 2℃。引物 Tm 值 60℃~65℃ 为佳。
- 引物碱基分布要均匀，避免出现连续的 4 个相同碱基，GC 含量控制在 50% 左右。3’ 端最后一个碱基最好为 G 或 C。
- 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。
- 引物特异性需要用 NCBI BLAST 程序进行核对。避免引物 3’ 端有 2 个碱基以上的非特异性互补。
- 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。